PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)所需資料
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1周前
4月26日,國家衛(wèi)健委舉辦全國視頻會議,明確提出“所有縣區(qū)級以上疾控機(jī)構(gòu)、二級以上綜合醫(yī)院要抓緊進(jìn)行改造,在短時間內(nèi)形成核酸檢測能力”。
各地的公立機(jī)構(gòu)檢測能力不能滿足需求只是暫時的,獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在充實(shí)檢測力量的同時,發(fā)揮自己豐富的檢驗(yàn)管理運(yùn)營理念,以及區(qū)域化覆蓋的經(jīng)驗(yàn)優(yōu)勢,融入到“國家隊(duì)”核酸檢測能力的建設(shè)中,順勢而為,乘勢而上。
隨著各地都在建立PCR實(shí)驗(yàn)室,本文從硬件基礎(chǔ)的角度,梳理了PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的幾個關(guān)鍵點(diǎn),獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以運(yùn)用豐富的運(yùn)營經(jīng)驗(yàn),進(jìn)行建設(shè)指導(dǎo)、人員梯隊(duì)建立、質(zhì)控體系搭建、區(qū)域化服務(wù)支持等。
如何建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室
與PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)相關(guān)的指導(dǎo)文件主要有四份:
《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》
《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》
《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》
《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》
要求臨床PCR實(shí)驗(yàn)室,不但在實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備等硬件上要滿足開展臨床檢驗(yàn)的條件,而且要求實(shí)驗(yàn)室在日常工作要有文件化的工作程序。
下面就在PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)過程中的幾個關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行闡述:
01
建立PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況編寫質(zhì)量體系文件,《質(zhì)量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導(dǎo)書》,并保證管理體系運(yùn)行有效。
管理體系的特點(diǎn)是應(yīng)有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機(jī)制、能自我發(fā)展的整體。
建立完善的SOP文件,對完成各項(xiàng)質(zhì)量活動的方法作出規(guī)定,每個SOP都應(yīng)對一個或一組相互關(guān)系的活動進(jìn)行描述。
每個SOP文件應(yīng)說明該項(xiàng)質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動的接口關(guān)系。
明確每個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項(xiàng)因素的要求,即由誰做、做什么、做到什么程序、達(dá)到什么要求,如何控制、形成什么記錄和報告,以及相應(yīng)的審批手續(xù)。
規(guī)定在質(zhì)量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應(yīng)簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴(yán)格遵守。
02
PCR實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)設(shè)置
要完成一組PCR實(shí)驗(yàn),通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析4個實(shí)驗(yàn)過程。
這4個實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房應(yīng)相鄰布置,組成一個獨(dú)立的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)包括:試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。
PCR實(shí)驗(yàn)室整體平面布局
某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局如圖1所示,整個區(qū)域有一個公用走廊,每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制,使整個PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染,并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
圖表1、某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面圖
試劑準(zhǔn)備區(qū)
該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。
試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū),不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱,計(jì)算冷負(fù)荷時,需要將它們計(jì)算在內(nèi)。
房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài),以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入,造成污染。
標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。
標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱,計(jì)算冷負(fù)荷時,需要將它們計(jì)算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū),還需要配備生物安全柜,用于進(jìn)行提取核酸的操作。
為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán),造成標(biāo)本之間的交叉污染,出現(xiàn)假陽性結(jié)果,該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實(shí)驗(yàn)室,排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器(www.gdlingjie.net)過濾后直接排至室外,不允許回到安全柜和實(shí)驗(yàn)室中。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn),如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜,每配備一臺,實(shí)驗(yàn)室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?,以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。
擴(kuò)增室
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外,已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
在巢式PCR測定中,通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管,因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
擴(kuò)增室主要配備PCR實(shí)驗(yàn)室的核心儀器PCR儀,本文實(shí)例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。
在實(shí)驗(yàn)室建造過程中,需要給PCR儀配備專門的UPS電源,以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。建議采用5~10Pa壓差,在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。
產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測,此區(qū)域可不設(shè)。
在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥,保證房間內(nèi)的相對負(fù)壓,空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m²~20m²。
本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源,因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓,以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差,在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。
03
正負(fù)壓區(qū)域緩沖室的設(shè)置
根據(jù)壓力梯度的要求,試劑配制室和樣品處理室為相對正壓,擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室為相對負(fù)壓,要求正壓的區(qū)域和要求負(fù)壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設(shè)計(jì)大不相同。
正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則,主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進(jìn)入室內(nèi)。正壓緩沖室的布置如圖2所示。
圖表2、正壓緩沖室的布置圖
負(fù)壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓,對緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要,如室內(nèi)無潔凈要求,此處可以為0壓)。負(fù)壓緩沖室的布置如圖3所示。
圖表3、負(fù)壓緩沖室的布置圖
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